細胞培養問題匯總答疑

復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。

凍存細胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內全部融化（不要超過3 分鐘）。

解凍后的細胞可以直接接種到含有*培養液的細胞培養瓶中直接進行培養，24小時后再用新鮮*培養液替換舊培養液，以去除DMSO。

如果細胞對冷凍保護劑特別敏感，解凍后的細胞應先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含*生長培養液的培養瓶中。

注：操作時戴好手套，防止凍傷；

帶上防護眼鏡可以防止液氮罐里剛剛拿

出來的管子液氮爆炸……

細胞培養時能否更換培養基種類？

首先得確定現在用的培養基是否適合您的細胞生長。

細胞培養過程中，細胞增殖和形態正常的情況下最好不要更換培養基，細胞都有各自適應的培養基，更換培養條件，細胞可能無法快速適應，導致細胞死亡。

若必須更換，可嘗試半換，讓細胞逐漸適應新的培養基。

更換培養基的方法：

如果是貼壁生長的細胞， 一般可以直接把培養液吸掉， 再加入新的。加的時候注意不要對著長細胞的那一面。

如果是懸浮型的， 就需要低速離心 （把所有的細胞和培養液轉移到離心管里， 或有些離心機配有直接離心細胞培養皿的裝置）， 然后再吸掉上清液。加入新的培養液使細胞重新懸浮。

首先要確定更換胎牛血清的理由，如果細胞培養無異常的話，不建議隨意更換不同品牌和來源的胎牛血清。

血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的來源（血源地）和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同地域和等級的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞死亡。

如果是使用的胎牛血清出現了問題，比如保存不當或操作不當導致血清成分析出、混濁、污染等情況，可以優先更換同品牌、等級、批次的血清。

如果是產品質量問題更換血清品牌的話，需要用一批細胞進行預實驗才行，以保證細胞能夠正常培養。

另外大家在購買胎牛血清的時候要選擇正規來源和經過海關檢疫胎牛血清，非正規來源的胎牛血清有很多安全隱患，對實驗室、操作人員、細胞培養、實驗數據都有很大的影響。

一般在拿到細胞后，應該注意什么？

收到細胞后先不要開蓋，放在培養箱靜置若干小時后（看細胞密度而定）在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照（建議對收細胞時的培養基拍一張照片，觀察培養基的顏色和是否有漏液情況，顯微鏡下拍細胞100X，200X各一張），排除細胞本身污染的情況；收到細胞未開封，出現污染狀況一般可以再申請免費發送一株細胞。

收到細胞時如無異常情況，請在顯微鏡下觀察細胞密度，如為貼壁細胞，未超過80%匯合度時，將培養瓶中培養液吸出，留下10ml培養液繼續培養；超過80%匯合度時，請按細胞培養條件傳代培養。如為懸浮細胞，吸出培養液、1000轉/分鐘離心2分鐘，吸出上清，管底細胞用新鮮培養基懸浮細胞后移回培養瓶。

細胞消化液建議使用PBS配制，慎用Hanks液配制。

培養細胞什么時候需要換液？

視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數據上的更換時間，按時更換培養基即可。

培養基到底要不要加抗生素？

除于特殊篩選系統中外，一般正常培養狀態下，培養基中不應添加任何抗生素。

如果是沒有進行過細胞培養的新手，對無菌技術沒有信心的，或者提取的原代細胞，怕污染的，可以適量添加抗生素。

抗生素本身也是有毒性的，有些抗生素的藥效濃度水平與毒效濃度水平非常接近，對細胞多少有傷害。

一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統，而培養基中NaHCO3的含量將決定細胞培養時應使用的CO2濃度。當培養基中NaHCO3含量為每公升3.7g時，細胞培養時應使用10%CO2；當培養基中NaHCO3為每公升1.5g時，則應使用5CO2培養細胞。

L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

酚紅一般作為培養基中pH值的指標：當培養基呈中性時為紅色，呈酸性時為黃色，堿性時為紫色。另外，酚紅可以模擬類固醇激素（特別是雌激素）的作用。如果要避免類固醇反應，可以在無酚紅的培養基里進行培養。

二價的離子會抑制胰酶活性，所以加入EDTA可以螯合掉Ca、Mg這樣的二價離子。

胰酶也要注意不要反復凍融哦！

如何避免細胞培養過程中的污染？

主要還是考慮無菌環境，盡量做好操作臺的滅菌，別把培養基滴落在生物安全柜的入風口，別在培養箱里把培養基打翻。這兩個地方霉菌一旦滋生，那你就只能等著用甲醛熏蒸了。

紫外無法殺滅霉菌，酒精也不行，只能用甲醛熏蒸，但是一定要注意安全。復蘇的時候，水浴鍋也需要進行滅菌處理。一旦出現污染，不要急，能救的就用抗生素救一下，但是一般情況下，選擇扔掉……

避免交叉感染，要不只能整個實驗室消毒了。