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★CQ★細胞培養需注意事項

★CQ★細胞培養在生命科研的地位舉足輕重。實驗君的很多成果可謂是成也細胞培養，敗也細胞培養。然而細胞虐我千百遍，我待細胞如初戀！科研人是不會這么被輕易打敗的。

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上海蒂科生物主營業務：胎牛血清（HAKATA、HyClone、SERANA、NTC、Corning、BOVOGEN、PAA、PAN、SIGMA），無外泌體血清(SBI)，ELISA試劑盒，細胞（400多種類通過STR鑒定），培養基（干粉、液體），雙抗，胰酶，CST,abcam,sigma等抗體。詳詢。

★CQ★新買或惠贈的細胞

1.新買的或惠贈的細胞如何處理？

不管買的細胞、惠贈的細胞，剛拿到手應趕緊做這幾件事：檢測瓶子是否破裂；培養基是否漏出，是否渾濁；是否有支原體污染；迅速擴增凍存。

2.能否使用與原先培養條件不同的培養基？

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養基，若驟然使用和原先提供培養條件不同的培養基，細胞大都無法立即適應，造成細胞無法存活。

3.購買的細胞死亡或存活率不佳可能原因？

常見原因可能有：培養基使用錯誤或培養基品質不佳；血清使用錯誤或血清的品質不佳；解凍過程錯誤；冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心；懸浮細胞誤認為死細胞；培養溫度使用錯誤；培養箱氣體濃度達不到要求；細胞置于 –80 ℃ 太久。

★CQ★復蘇凍存的細胞

4.收到的冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落的原因？

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，是因熱脹冷縮的物理現象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊。

5.冷凍管應如何解凍？

將冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，可佩戴防護眼鏡和手套預防冷凍管的爆裂。取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃ 水浴環境中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內全部融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損害。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發生污染情形。

6.細胞冷凍管解凍培養時，是否應馬上去除 DMSO？

現在大多數實驗室會在解凍細胞后加培養液將DMSO除去，但也有研究者認為除少數特別注明對 DMSO 敏感的細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，可直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養基的培養角瓶中，待隔天再置換新鮮培養基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題。

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★CQ★細胞培養用液

7.如何正確選擇培養基種類？

引用幾款比較經典的培養基舉例：

8.如何選用特殊細胞系培養基？

培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在 MEM 中培養的細胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長。總之，shou選 MEM 做粘附細胞培養，RPMI-1640 做懸浮細胞培養是一個好的開始。

9.什么培養基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。

10.細胞培養基的配制和儲存應該注意什么？

細胞培養基配好后，要先抽取少許放入培養瓶內在37℃培養箱內放置24~48h，已檢測培養液是否有污染，然后方可用于實驗。配置培養基所需的血清要合格并且保持穩定。一個批號試用效果良好后，就可一次購入較多同一批號的血清，這樣實驗條件穩定，配液時調整pH值較容易。每次配液量以使用兩周左右的量為宜，一次配液不要太多，一是短期內用不完造成營養成分損失需要補充，二是量大易造成污染。

11.為何培養基保存于 4 ℃ 冰箱中，顏色會偏紫色？

培養基保存于 4 ℃ 冰箱中，培養基內的 CO2 會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性，而培養基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red） 的顏色也會隨堿性增加而更偏紫色。培養基偏堿的結果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時，可以通入無菌過濾 CO2，以調整 pH 值。

12.什么情況下用到無血清培養基？

對于應用培養細胞進行分離制備細胞生長因子、單克隆抗體等應該選擇無血清培養基。

13.如何選擇正確的血清種類？

14.可否使用與原先培養條件不同的血清種類？

不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

15.血清滅活是否必須？

這個問題現在有爭議。有人主張價格不菲的血清中含有諸如生長因子，維生素，氨基酸等珍貴物質，而將它們置于50℃以上的溫度長達30分鐘的熱處理會對血清中的生長因子，氨基酸等成分帶來的負面影響。盡管如此，在大多數實驗室之中血清的熱滅活還是作為常規來執行，尤其是在昆蟲細胞和胚胎干細胞培養中。

16.培養基中是否添加抗生素？

除特殊篩選系統中外，一般正常培養狀態下，培養基中不應添加任何抗生素。

17.何時更換培養基？

視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數據上的更換時間，按時更換培養基即可。

★CQ★細胞傳代

18.細胞傳代的方法都有哪些？

根據不同的細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細胞用直接吹打即可傳代；懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。

19.原代培養的*傳代應注意的問題？

細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代；原代培養時細胞多為混雜生長，不同的細胞有不同的消化時間，因此要根據需要注意觀察及時處理，并根據不同細胞對胰蛋白酶的耐受時間而分離和純化所需要的細胞；

吹打細胞時動作要輕巧盡可能減少對細胞的損傷；*傳代時細胞接種數量要多一些，使細胞能盡快適應新環境而利于細胞生存和增值；隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養瓶。

20.使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的？應如何處理？

EDTA作用較胰蛋白酶緩和，主要作用在于能從組織生存環境中吸取Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要因素。但EDTA單獨使用不能使細胞*分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好。常用比例為1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液濃度為0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA，在終止消化前，需用緩沖液將消化液清除后才能加培養液。*次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復冷凍解凍造成胰蛋白酶的活性降低，并可減少污染的機會。

21.欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？

欲回收動物細胞，其離心速率一般為800~1000 rpm，5~10 分鐘，過高的轉速，將造成細胞死亡。

22.細胞的接種密度為何？

依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的重要原因之一。

23.細胞交叉污染的可能原因？

多種細胞系進行維持傳代操作時，各細胞系所需的器材和溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。

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★CQ★細胞凍存

24.冷凍培養基為什么要加DMSO？

因為細胞在不加任何保護劑的情況下直接凍存時，細胞內外的水分都會很快形成冰晶，冰晶的形成將造成細胞損傷，還可引起細胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保護劑。這兩種細胞無明顯毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高包膜對水的通透性。

25.DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何？

冷凍保存使用的 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO，其本身即為無菌狀況，*次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4 ℃，避免反復冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質，并可減少污染的機會。若要過濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質濾膜。

26.欲冷凍保存時，細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？

冷凍管內細胞數目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

27.冷凍保存細胞的方法？

冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →-20 ℃ 30 分鐘 → -80 ℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 長期儲存。

冷凍保存方法二： 冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。–20 ℃ 不可超過 1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。

28.細胞凍存太多會不會浪費？

每一種細胞系都應有充足的凍存儲備，防止由于細胞污染等因素造成的細胞系的絕種，而且每一批次培養的細胞狀態都不同，應該挑選幾個狀態較好的批次凍存保種。另外二倍體細胞等有限細胞系如果暫時不用凍存以免傳代太多，造成細胞衰老或者發生改變。

29.如何識別和預防常見的細胞污染？

細菌污染：細菌是一種原核細胞微生物，其大小以微米(μm)計。常見的污染細菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌、假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見。

一旦發生細菌污染較易發現，多數情況下培養液短期內顏色變黃，表明有大量酸性物質產生，出現明顯混濁現象；有時靜置的培養液液體初看不混濁，但稍加振蕩，就有很多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養液中有大量圓球狀顆粒漂浮。必要時可取少量培養液涂片染色檢查以證實細菌種類；有的培養液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養液接種，也可取10ml細胞懸液以100rpm離心5min，沉淀中加入無抗生素的培養液2ml，置于37℃培養，24h可得結果。污染后細胞發生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。

看到這種，別猶豫了你的細胞被污染了，那么怎么辦呢，基本原則立馬扔掉，別擴大污染，如果你的細胞真的十分寶貴，先用帶有雙抗的PBS反復沖洗幾遍，然后再培養液中加入硫酸慶大霉素、新霉素（50ug/ml）等，培養3天后換成帶有雙抗的培養液培養。

真菌污染：是細胞培養過程中較常見的一種，尤其在梅雨季節進行細胞培養更易污染。污染培養細胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數在培養液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見，較易被發現，短期內培養液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細胞之間縱橫交錯穿行的絲狀、管狀、及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養液中。很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態呈卵形，散在細胞周邊和細胞之間生長。鏡下看時，要將培養瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但后由于營養耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。

真菌污染真的不建議處理，因為孢子容易飄散，可能這瓶沒9過來，又擴大了污染，建議預防為主，在培養箱的水中加入硫酸銅，就是藍色的那種東西。哎，如果你非救不可，可以采用兩性霉素B（0.25-2.5），三天后換液加入含PS的培養液。

支原體污染：支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(小直徑0．2um)并獨立生活的微生物。約有1%可通過濾菌器。支原體無細胞壁形態呈高度多形性。可為圓形、絲狀或梨形。

支原體形態多變，在光境下不易看清內部結構。電鏡下觀察支原體膜為三層結構。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。

支原體污染細胞后，培養液可不發生混濁。多數情況下細胞病理變化輕微或不顯著，細微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。但個別嚴重者，可致細胞增殖緩慢，甚至從培養器皿脫落。

如果懷疑細胞被支原體污染可使用支原體檢測試劑盒進行檢測，如果確定是支原體污染可以選擇支原體去除試劑進行處理。

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